細(xì)胞培養(yǎng)的成功跟細(xì)胞消化有關(guān)嗎？

細(xì)胞培養(yǎng)的成功跟細(xì)胞消化有關(guān)嗎？

導(dǎo)讀

因?yàn)橐恍┨厥獾脑颍囵B(yǎng)接觸過(guò)近300種細(xì)胞，常用于做實(shí)驗(yàn)的，累積有百余種，可以說(shuō)遇到過(guò)各式各樣古怪的細(xì)胞。這里挑細(xì)胞消化做一篇專題，并不是因?yàn)榧?xì)胞消化最重要，而是近期看到大家頻繁討論這個(gè)話題，我就拋磚引玉，下面幾點(diǎn)拙見，可能與其它朋友總結(jié)的一些經(jīng)驗(yàn)有點(diǎn)出入，僅供大家參考。

細(xì)胞消化的一般程序步驟，細(xì)節(jié)操作，我這里就不講了，只講一些基本操作背后的知識(shí)，如有不妥之處，歡迎指正，一起討論：

1. 絕大部分細(xì)胞消化的時(shí)候是只要用胰酶潤(rùn)洗一遍即可。吸去胰酶后，殘留的那些無(wú)法計(jì)算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細(xì)胞（絕大部分1min不到）。對(duì)于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代，對(duì)細(xì)胞傷害很大。簡(jiǎn)單的程序是PBS潤(rùn)洗吸去，胰酶潤(rùn)洗吸去，然后37℃消化。

2.怎么樣算是消化好了呢？不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動(dòng)了，多半呈沙壯移動(dòng)，其實(shí)已經(jīng)可以了，很多人喜歡把細(xì)胞消化或者吹打成完全分離細(xì)胞，這是沒有必要的。一般能移動(dòng)了，說(shuō)明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個(gè)時(shí)候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。細(xì)胞就是完全成單個(gè)細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過(guò)程中仍然會(huì)聚集，這個(gè)是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特性，無(wú)論死活的細(xì)胞都是如此，你可以嘗試，準(zhǔn)備100%的單個(gè)細(xì)胞懸液，貼壁后觀察細(xì)胞，仍然是幾個(gè)幾個(gè)細(xì)胞聚集在一起。一些懸浮培養(yǎng)細(xì)胞也是如此，容易聚集，不要去嘗試過(guò)幾個(gè)小時(shí)就拿出來(lái)吹打成單細(xì)胞懸液（不要笑，這個(gè)是初養(yǎng)懸浮細(xì)胞的人常犯的錯(cuò)誤，以為懸浮培養(yǎng)就是一個(gè)一個(gè)分開）。細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來(lái)，這個(gè)時(shí)候即使是成片的（比如Calu-3細(xì)胞），吹打不超過(guò)20次后（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個(gè)細(xì)胞左右），是正常的，不要試圖再去延長(zhǎng)消化時(shí)間，或者象有的同學(xué)那樣吹打1h，等待單細(xì)胞懸液出現(xiàn)。

3.另一個(gè)帖子里提到一個(gè)比較復(fù)雜的四步消化法，這個(gè)挺有意思，我也是第一次聽說(shuō)，應(yīng)該是網(wǎng)友自己發(fā)展出來(lái)的方法，很有參考價(jià)值。但我估計(jì)這個(gè)方法可能對(duì)付少數(shù)非常怪異的細(xì)胞才需要這么復(fù)雜的程序。我目前養(yǎng)過(guò)的近300株細(xì)胞里面，還沒遇到這么怪異的。比如Caco2其實(shí)是很好消化的細(xì)胞，不需要胰酶孵育即可，只是有點(diǎn)成片分布。不要以為成片分布是自己沒養(yǎng)好，這個(gè)視細(xì)胞而定。如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致，那可能是自己沒消化好導(dǎo)致的，但如果消化方法正確，仍然成片分布，甚至完全吹打成單細(xì)胞懸液，貼壁后仍然成片分布，這是細(xì)胞的特性，是因?yàn)橘N壁過(guò)程中重新聚集了。這個(gè)時(shí)候你拼了命要去讓它均勻分布，你的細(xì)胞之后會(huì)對(duì)你越來(lái)越不好。

4.比較難消化的細(xì)胞（潤(rùn)洗方法5min還不能消化），就以coloncancer為例，比如HCT15,LS411和KM12，這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100mm dish，一次最多加入500ul，就足夠了，一般我加300ul。即使這樣難消化的細(xì)胞，一般不超過(guò)5min，即可見細(xì)胞成片移動(dòng)，就應(yīng)該停止消化。一些正常細(xì)胞也會(huì)有難消化的時(shí)候，比如tsDC細(xì)胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動(dòng)。

5.常規(guī)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（增殖，凋亡，遷移，分化之類的），受消化影響不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用潤(rùn)洗的方法消化（難消化細(xì)胞例外）即可。但少數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如病毒包裝，對(duì)細(xì)胞代數(shù)，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)要求極高。這個(gè)時(shí)候，胰酶消化，就是潤(rùn)洗，都會(huì)對(duì)細(xì)胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細(xì)胞包裝能力就會(huì)逐漸下降（當(dāng)然也有其它因素影響包裝效率）。這個(gè)時(shí)候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過(guò)影響ECM相關(guān)酶的活性，來(lái)使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。

6.EDTA的作用。許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用trypsin/EDTA聯(lián)合作用。這里要明白，trypsin切割ECM的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白，而EDTA通過(guò)螯合Ca離子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者對(duì)付特別難消化的細(xì)胞，添加多一些EDTA，就是這個(gè)道理。一般不要試圖延長(zhǎng)消化時(shí)間（如果10min還消化不徹底的話），而應(yīng)該想其它辦法。

7.PBS洗滌。消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因?yàn)镾erum含有抑制trypsin的蛋白。但這里面也有學(xué)問(wèn)可以講，對(duì)于一些難消化細(xì)胞，那么可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因?yàn)檫@些離子也會(huì)抑制trypsin的活性。但對(duì)于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤(rùn)洗即可消化的細(xì)胞，不需要配制如此溶液。

總結(jié)下來(lái)，雖然這篇文章是關(guān)于消化的，但其實(shí)消化并不是細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵所在（雖然很重要），關(guān)鍵所在是細(xì)胞來(lái)源，血清質(zhì)量和水源（自己配制溶液的話）。我看到版上許多人養(yǎng)細(xì)胞遇到各種各樣的問(wèn)題，很多時(shí)候bottleneck沒有找到，雖然通過(guò)其它方法有所改善，但仍然是事倍功半。因?yàn)槿藗兺⒁庾约旱牟僮?，總覺得自己沒有經(jīng)驗(yàn)，而忽視試劑，溶液尤其是細(xì)胞的質(zhì)量，后者其實(shí)才是許多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常見的問(wèn)題。

1分辨血清來(lái)源，切勿上當(dāng)受騙由于瘋牛病的原因，到目前為止我國(guó)政府仍然禁止從北美洲、歐洲和日本等有疫情的地區(qū)進(jìn)口牛血清，因此市面上的牛血清大多來(lái)自澳洲（SAFC牛血清的血源，Corning的澳洲胎牛血清的血源就是來(lái)自澳洲嗒）、南美洲，或是國(guó)產(chǎn)的。至于來(lái)源于巴西的、以色列的血清，大家還是看看就好，切莫隨意行動(dòng)。

2嚴(yán)查生產(chǎn)質(zhì)檢，減低批間差別血清批次間的差別是不可避免的，這種差異來(lái)源于不同的制備方法和除菌方法、動(dòng)物的年齡差別、血清的儲(chǔ)存條件、動(dòng)物的來(lái)源等。因此血清的生產(chǎn)、過(guò)濾、消毒、質(zhì)檢流程的嚴(yán)格控制以及長(zhǎng)期穩(wěn)定的血清供應(yīng)更顯的尤為重要，這一點(diǎn)國(guó)產(chǎn)的很多血清就望塵莫及啦。